NGS即Next-generation sequencing,又叫第二代測序技術(shù)或者高通量測序技術(shù)或者下一代測序技術(shù)。
文庫是DNA/RNA樣本在測序前做的一系列準備,因為原始的核酸樣本無法直接用于測序,只有經(jīng)過處理的樣本才能滿足測序平臺的要求,比如在DNA樣本兩端添加測序bi備的接頭;樣本量不足時,可以通過PCR擴增達到上機的要求等。NGS測序為什么需要文庫構(gòu)建?讓我們一起來看看吧!
一、DNA文庫構(gòu)建的內(nèi)容
(1)片段化及末端修復
(2)加接頭
(3)PCR
注意:此處忽略磁珠純化的步驟。
RNA樣本的文庫構(gòu)建更加復雜,需將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進行上述的建庫流程,原理相同。
二、gDNA樣本在NGS建庫前要進行片段化的原因
Illumina測序儀可讀取的片段長度范圍在50-600bp(圖1), 不同測序芯片和測序試劑,對應測序長度不同。而大部分完整人類gDNA長度≥10kb。所以對于大片段的DNA/RNA樣本,打斷是文庫構(gòu)建的前提。(這個理由同樣適用于MGI平臺)
DNA測序應用 | |
應用 | 推薦讀長 |
全基因組測序 | 2 X 150 bp |
全外顯子測序 | 2 X 150 bp |
靶向捕獲測序 | 2 X 150 bp |
擴增測序 | 整個擴增子插入片段長度 |
從頭測序 | 2 X 150 - 2 X 300 bp |
RNA測序應用 | |
應用 | 推薦讀長 |
轉(zhuǎn)錄組分析 | 2 X 75 bp |
基因表達譜分析 | 1 X 50 bp |
小RNA測序 | 1 X 50 bp |
圖1.Illumina測序平臺針對不同應用推薦的測序讀長
三、DNA片段化后要加接頭(adapter/index)的原因和意義
一個完整的接頭包含三部分:通用引物(P5&P7) + index(i7/i5) + 測序引物(SP1&SP2)(圖2)
1. 通用引物用于簇生成,測序引物用于插入片段的測序;
2. 測序平臺決定接頭序列;
3. index用于區(qū)分同一批測序數(shù)據(jù)的不同樣本。當同一張芯片測序樣本數(shù)≥2時,由index來區(qū)分樣本。如果一張flow cell只上一個樣本,index可以不需要,但是通用引物(P5&P7)和測序引物(SP1&SP2)是必需的。
備注:樣本加上完整接頭的方式有至少有3種,但是最終文庫的接頭序列是一致,找時間專門寫一個接頭不同結(jié)構(gòu)與連接方式的文章。
圖2 不同接頭結(jié)構(gòu)的文庫
四、PCR和PCR-free兩種文庫的常見性問題
PCR是實現(xiàn)樣本量的手段之一。當投入的起始量較低,構(gòu)建的文庫量較少,需要通過 PCR復制模板量,最終達到上機需求的量。反之,當樣本起始量足夠多的情況下,只需完成接頭連接,純化后即可上機測序。
但是PCR文庫比較常見。
1. 大部分樣本的起始量并不能直接滿足上機需求
2. 不經(jīng)過PCR擴增的文庫,由于接頭呈現(xiàn)Y型,其物理結(jié)構(gòu)特殊,容易導致文庫質(zhì)控結(jié)果出現(xiàn)偏差
3. 接頭與模板比例高,純化不干凈,導致文庫的接頭殘留嚴重,降低整個文庫質(zhì)量
五、不同試劑盒對樣本起始量要求不同
不同試劑盒會有不同的樣本起始量要求。試劑盒能滿足的樣本起始量主要是由它自身酶的靈敏度、特異性以及穩(wěn)定性決定的。樣本起始量越低 (如新冠鼻咽拭子樣本),對酶的要求越高,相對的價格也越高。而且針對低起始量樣本建庫的試劑盒都有各自的技術(shù)zhuan利和優(yōu)勢,所以也是價格高的另一個原因。
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